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文獻解讀|實例分析體外培養類器官的全面檢測與評估
發表者:北京博奧森生物      發表時間:2019-7-22


引文

過去幾年里,“類器官”(organoids) 這個名詞開始逐漸興起,大家可能聽說過它的名字。類器官(organoid) 是能夠在實驗室中利用人的干細胞培養出的微型器官,與來源組織和器官高度相似。類器官可以說是神奇的“多面手”,它既能夠讓我們更好地理解機體的發育過程,同時被作為疾病模型協助新藥研發,幫助我們治愈疾病。當然,科學家也期待著能夠利用類器官替換病人體內受損的組織,用于再生醫學。

正文

最近的一篇發表在Nature Methods的報道,采用了一種在毫米流控芯片上(流式培養)體外培養腎器官的方法,該方法擴大了內皮祖細胞的內源性集群,并通過管壁細胞所包圍的可灌注腔生成血管網絡。為了評估不同培養方式得到的類器官在某一方面的性狀和生理功能,常常需要對類器官的各種發育與細胞分化相關標志物進行鑒定。在這篇報道中,研究人員發現具有粘附作用的胞外基質(ECM)比不具有粘附作用的ECM為類器官中的血管發生提供了更好的培養條件,從血管發生相關標志物MCAM、PECAM1以及PODXL的染色情況可以明顯觀察到兩者的效應差異(圖1b)。為了評估流式培養腎臟類器官的血管形成情況,研究人員繼續觀察了在高流體剪切力(FSS)下體外培養的細胞器中MCAM和PECAM 1血管網絡在灌注10d后(即分化第21天)中的增強形成(圖1 c~e),并隨著時間的推移形成了新的腎單位(圖1 i~l),提示FSS是促進體外培養腎臟類器官的血管生成的環境因素。

1:在高流體流動下體外培養的腎器官在腎發生過程中表現出增強的血管形成作用。a. 在毫米流控芯片內的工程化的ECM上進行受控于FSS的腎臟類器官的體外培養。分化天數和培養在面板的中部和底部指示條件。未按比例繪制的器官ID。b.對在粘附性或非粘附性ECM上培養的類器官的DNA、MCAM、Pectam1和Podxl等標志物進行染色。比例尺,100μmc~h. FSS下培養的整個器官免疫染色(c~e)和相差顯微結果(f~h)的對比圖像(第12-21天)。比例尺:50μmc~e)或300μmf~h),灌注方從左至右。i~l,在靜態U井、靜態工程ECM、低FSS和高FSS條件下培養的類器官整體血管標記的共聚焦3D渲染。比例尺,100μmm. 血管系統的豐度和特征的統計結果,報告為相對于U井培養條件下各個參數的倍數變化。 n. 在各種生長條件下PECAM1表達的定量PCR分析結果

在高FSS情況下,PDGFRβ表達上調(圖2e),其中PDGFRβ周細胞樣細胞向PECAM 1+網絡的募集與血管成熟一致(圖2F)。當這些腎器官內的血管在體外進化時,研究人員注意到血管前體和成熟標記物的異質表達,包括灌注10d后的MCAM單陽性、PECAM 1單陽性或MCAMPECAM 1雙陽性區域(分化第21天) (圖2g)。研究人員觀察到無核的開放圓形結構 (DAPI染色陰性),并被MCAM陽性和PECAM 1陽性區域包圍,這些區域指示不同直徑的器官腔,反映多尺度血管的形成(圖2h)。值得注意的是,研究人員觀察到暴露于高FSS人多能干細胞 (hPSC) 衍生的腎臟器官 (圖2i,j)具有和14.5日齡小鼠腎臟的類似結構(E14.5;圖2K)。為了確定全腎器官中可灌注血管的程度,研究人員先在培養基中注入幾個小時的熒光微珠(beads),然后在嵌入ECM的細胞器上獲得實時共聚焦圖像(z-軸堆積)。這些器官隨后固定,對PECAM 1進行免疫染色,并與其他標記共染。研究人員觀察到熒光微珠出現在與更大的PECAM 1血管相一致的位置(圖2 lm)。

2:在體外培養的腎組織中,觀察到細胞器內和細胞器間血管網有壁細胞支撐的可灌注腔。a. 腎內皮細胞在體內發育過程中的成熟圖,從祖細胞到持續的終末標記表達。b. 培養21天分離的整個類器官的流式細胞分析。EPC為FLK 1陽性細胞群。c.d. 培養第21天內皮細胞標記物的定量PCR分析結果e. 在第21天發育器官中PDGFRβ的定量PCR分析結果 f. PODXL、PECAM 1和PDGFRβ在高FSS下的免疫染色。比例尺,15μM.  g. 內血管標記的類器官整體共聚焦三維染色。比例尺,30μM。白色箭頭突出顯示的區域是PECAM1+MCAM-h. 圖g中的一個z軸圖像切片,其中白色箭頭突出顯示打開的管腔。比例尺,30μM. I~k,透射電鏡圖像顯示在高FSS(I,j) E14.5小鼠胚胎腎臟(k)下,由一層薄膜包裹的圓形開口,反映腎臟器官的血管腔。紅色加號顯示血管腔。比例尺,10μm (i,k) 2μm(J)。lm,在高FSS下培養的腎臟細胞器底部z軸圖像切片,顯示血管網(l)和熒光微珠在血管網(m)內的積聚。比例尺,100μMn. 共聚焦3D染色顯示橋接的兩個相鄰的類器官(由虛線白線勾勒)。


研究人員還利用多重血管發生標記物抗體進行免疫熒光染色結合3D共聚焦成像觀察體外形成的腎小管極性增強,管狀上皮在流動條件下表現出明顯的成熟,并經過形態發生,在芯片上的高流量條件下,成為與血管接觸的極化纖毛區室(結果未出示)。并且流式培養的腎臟類器官增強重現了在體內的腎小球發育早期階段的腎小球血管形成和形態發生(結果未出示)。

總而言之,利用發育和細胞分化標志物抗體進行免疫染色并結合多種共聚焦染色技術(如全器官的3D共聚焦染色)對于對類器官的各項進行功能鑒定,是類器官研究的一項重要支撐技術平臺,極大地提升了對于類器官發育和功能的分析精度,可以更好地幫助研究人員評估類器官培養方式的有效性。



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2019年7月15日至2019年10月31日。


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2. 試用裝需自付運費,以到付形式發放。
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